کروماتوگرافی ستونی مایع – HPLC
روش جدید کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا HPLC که کروماتوگرافی مایع با سرعت بالا (HSLC) نیز نامیده میشود، به صورت روشی استاندارد برای جداسازی با ستون در آمده است.
اساس این روش با روش معمولی ستونی تفاوتی ندارد، بلکه فقط از نظر دستگاه و روش عمل تفاوت‌هایی وجود دارد. مزایای عمده hplc نسبت به LC سرعت قدرت تفکیک حساسیت زیاد آن وسهولت کار برای تجزیه های کمی است.
هنگامی که ستون پر میشود در جریان حلال محدودیتی ایجاد می گردد. هر قدر ستون بلند تر و ذرات ماده جاذب کوچکتر باشند این محدودیت حرکت حلال بیشتر است. اگر جریان حلال در داخل ستون با اعمال نیرو برقرار شود یک فشار معکوس ایجاد خواهد شد.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا
در روش LC از ذرات متخلخل درشت استفاده شده است. با قطر داخلی ۱-۵ سانتی متر برای عبور حلال از میان این ذرات درشت فشار کمی مورد نیاز است. معمولاً مقدار کمی مایع در بالای سطح ذرات ماده جاذب یا در بعضی از موارد، یک مخزن که در بالای ستون قرار داده می شود به عنوان منبع فشار دائمی عمل می کند در این شرایط فشارمایع عبور کننده بین ۰.۱ تا ۱ اتمسفر است. سرعت جریان مایع بسیار کم است و زمان جداسازی بسیار طولانی است اگر سعی کنیم سرعت جاری شدن حلال را بالا ببریم کارایی ستون و قدرت تفکیک آن به علت محدودیت های ناشی از انتقال جرم کاهش خواهد یافت . منحنی ارتفاع ستون (H) بر حسب سرعت حلال (V) برای چنین ستونهایی دارای شیب زیاد خواهد بود از این رو در این موارد سرعت جریان باید کم باشد. از سوی دیگر ذرات درشت به علت دارا بودن سطح زیاد یا ظرفیت تعویض یونی بالا، مقدار زیادی نمونه را می توانند بپذیرند که این ویژگی در کروماتوگرافی کمی تهیه ای بسیار مهم است. در عمل پودرهای متشکل از ذرات درشت متخلخل را می توان با قیمت مناسبی خرید و ستون های شیشه ای ساده را از آنها پر کرد. اگرچه قبلا پیش‌بینی می‌شد که افزایش کارایی ستون با کاهشdp ممکن میشود اما از سالهای ۱۹۶۰ اندازه ذرات پرکننده ستون بیشتر مورد توجه قرار گرفت. ذرات پر کننده هنگامی که برای پر کردن ستون های باریک به کار می روند، فشار معکوس بیشتری نسبت به ستون های LC معمولی ایجاد می کنند. از این رو برای کمک به جاری شدن فاز متحرک در داخل ستون پمپ های پر فشار مورد نیاز هستند این نقطه آغاز و پیدایش hplc بود. در hplc تجزیه ای ، سرعت جریان بین 0.5-5ml/min و افت فشاری تا ۳۰۰اتمسفر حاصل شد. از طرف دیگر کارایی ستون نسبت به LC ۱۰ تا ۱۰۰ برابر افزایش یافت و زمان جداسازی کوتاه شد.
این پیشرفت‌ها نتیجه تولید توسعه مواد پر کننده پوسته ای در سالهای ۱۹۶۰ بود. این ذرات پرکننده کروی متشکل از هسته های کروی و بدون منفذی (معمولاً دانه های شیشه ای به قطر تقریبی ۴۰ میکرومتر) است یک لایه نازک متخلخل روی آنها را پوشانده شده است
پوسته خارجی که معمولاً ضخامت آن 1-3 میکرومتر است می توانند سیلیکاژل، آلومین، رزین یا پلی آمید باشد. ذرات پوسته ای، به علت هسته جامد به متراکمی که دارند، به آسانی در داخل ستون پر می شوند. در مقایسه با ذرات متخلخل با قطر برابر، انتقال جرم فاز ساکن در این پوسته نازک به طور قابل توجهی بهتر است. اما به علت نازک بودن این پوسته Vs به مقدار قابل ملاحظه‌ای کاهش می‌یابد و ظرفیت پذیرش نمونه 0.05-0.1 برابر ذرات کاملاً متخلخل است. بنا براین مواد پر کننده پوسته ای در LC تهیه ای چندان مفید واقع نمی‌شوند. ستون مواد پر کننده پوسته ای مصرف شده را میتوان به عنوان ستون های محافظ (صافی و جداکننده ناخالصی‌ها) بین تزریق کننده و ستون تفکیک کننده قرارداد.
کاهش dp تا حد کمتر از ۳۰ میکرومتر برای ذرات متخلخل منجر به بهتر شدن کارایی ستون می شود. مزایای استفاده از ذرات ریز کروی، در حدود 10 میکرومتر، برای اولین بار در کروماتوگرافی تعویض یونی مورد توجه قرار گرفت. رزین های تعویض یونی به وسیله روش ته نشینی یا شستشو سنتز می شوند و بر مبنای اندازه ذرات تفکیک می گردند. تولید تجارتی ذرات ریز و تکنولوژی انباشتن ستون از آنها تا سال ۱۹۷۰ موجود نبود. اما امروزه روش های تولید ذرات و تفکیک آنها را از نظر قطر و اندازه و روشهای انباشتن ستون از آنها فراهم شده است و در نتیجه، پیشرفت های بزرگی در زمینه hplc به دست آمده است. ذرات ریز با اندازه ۵ – ۱۵ میکرومتر برای ستونهای hplc با کارایی بالا به کار می روند. افزایش کارایی ناشی از اصلاح در ترمهای انتقال جرم فاز ساکن و فاز متحرک است در نتیجه زمان جداسازی و مقادیر H به0.1 تا 0.01 آنچه در LC معمولی داریم کاهش می‌یابد. به علاوه چون سطح ذرات ریز بر خلاف ذرات پوسته ای به اندازه ذرات متخلخل درشت می باشد، ظرفیت پذیرش نمونه بالایی دارند. متاسفانه این مواد پرکننده گران بوده و پر کردن ستون از آنها مستلزم به کار بردن تکنیک های ویژه می باشد. از آنجا که کارایی ستون های پر شده یا ذرات میکرو بسیار زیاد است(مقادیر H بین یک 0.01 تا 0.03 میلیمتر(در کارهای تجزیه به وسیله hplc از ستون های کوتاه )۱۵ تا ۲۵ سانتیمتر( استفاده می شود. استفاده از ذراتی با اندازه حدود ۵ میکرومتر باید فشار معکوس بیشتری نسبت به ذرات متخلخل درشت یا ذرات پوسته ای ایجاد کند. اما، این ستونهای کوتاه، هنگامی که از فاز متحرک غیر گرانرو با سرعت جریان 1-2mL/min استفاده می شود، فشار معکوس متوسطی(کمتر از ۲۰۰ اتمسفر) از خود نشان می‌دهند. در جداسازی های مشکل‌تر که ممکن است ده‌ها هزار صفحه نظری مورد نیاز باشد، ستونهای بلند ۵۰ تا ۱۰۰ سانتیمتر با ریزترین ذرات ممکن و سیستم تغذیه حلال پرفشار مورد استفاده قرار می‌گیرد. به همین ترتیب، نحوه استفاده از فاز متحرک گرانرو یا سریع منجر به افزایش فشار معکوس در ستون خواهد شد. در این موارد افت فشار ممکن است تا چند صد اتمسفر برسد.
ستون های کروماتوگرافی مایع
در کروماتوگرافی ستون باز، یک لوله شیشه‌ای، فلزی یا پلاستیکی که انتهای آن باریک شده است به عنوان ستون به کار میرود. برای نگاه داشتن ماده پرکننده در ستون یک لایه پشم شیشه یا یک توری فلزی در انتهای ستون قرار داده می شود ذرات جامد از بالا در ستون ریخته می شوند تا ستون پر شود . ستون باید به طور فشرده پر شود و هیچ فضای خالی در آن نباشد. اگر چه جاری شدن مایع در داخل ستون پر شده توسط نیروی وزن آن انجام میشود، اما هنگامی که ذرات ریز هستند (قطر کمتر از ۱۰۰ میکرومتر) می توان از پمپ استفاده نمود. برای کارهای معمولی با ستون باز در فشارهای کم ستون های شیشه‌ای مفید هستند. اما در فشارهای بالا (بالاتر از ۷۰ اتمسفر) معمولاً از ستون های فولادی و مقاوم استفاده می شود. درجه حرارت ستون را با قرار دادن آن در یک اجاق یا به وسیله یک مقاومت الکتریکی و یا با استفاده از یک جداره محتوی آب می توان کنترل کرد و در حد مطلوب نگه داشت. درHPLC اخیرا ستون های باریکتر (قطر داخلی کوچکتر) مورد توجه قرار گرفته اند. استفاده از این ستون ها ستون های میکرو بور (نازک) نامیده می‌شوند مزایایی دارد. نخست اینکه به ازای غلظت‌های برابر، ستونهای باریک پیک های تیزتر و بلندتری می دهند که به معنای بیشتر شدن مقدار ترکیب جدا شده است. این امر به نوبه خود موجب بالا رفتن حساسیت آشکارساز می گردد. این افزایش به ویژه در تجزیه و تحلیل مقادیر کم که مقدار کل ماده محدود می باشد، مهم است.
هر یک از اجزای کروماتوگراف مایع در جداسازی نقش معینی دارند.
