اسپکتروفتومتری چست؟

1- مقدمه اسپکتروفتومتری

اسپکتروفتومتری: روش های جذب سنجی یکی از قدرتمندترین و رایج ترین روش های اندازه گیری طیف وسیعی از آنالیت ها محسوب می شود. بسیاری از دستگاه های مورد استفاده بر پایه اندازه گیری میزان جذب با عبور انرژی تشعشعی ساخته شده اند. دستگاه هایی که برای جذب سنجی به کار می روند فتومترها و اسپکتروفتومترها هستند که در دهه 1940 ابداع شدند. در فتومترها ابزاری برای تهیه طیف وجود ندارد و تنها در طول موج مشخصی کار می کنند و از روی شدت نور جذب شده توسط ماده، آنالیز صورت می گیرد. این دستگاه می تواند از فیلتر نوری استفاده کند اما در دستگاه اسپکتروفتومتر امکان تهیه طیف و اندازه گیری جذب در طول موج های مختلف وجود دارد. دستگاه های اسپکتروفتومتر به جداسازی و اندازه گیری تغییرات انرژی هسته ها، یون ها و یا مولکول ها می پردازند که این تغییرات ناشی از برهم کنش اشعه الکترومغناطیس با ماده می باشد. روش های اسپکتروفتومتر شامل انواع مختلفی از جمله اسپکتروفتومتری مرئی(vis) ، فرابنفش (uv/vis) ، فرابنفش ، مرئی ، نزدیک مادون قرمز نزدیک ( NIR/Vis/Uv) ، نشر شعله (Flame) ، جذب اتمی (Atomic Absorption) می باشد که با این روش ها میتوان نمونه را مورد تجزیه و تحلیل کمی و کیفی قرار داد. در این جا به مطالعه روش های اسپکتروفتومتری مرئی – فرابنفش (UV/Vis) می پردازیم.

1 روش های اسپکتروفتومتری در ناحیه مرئی – فرابنفش (UV/Visible)

1.2 روش رنگ سنجی ( Colorimetry) در ناحیه مرئی تابش

در ناحیه مرئی (400-700nm) ، جذب یا انتقال ماده می تواند به رنگ آنالیت مربوط باشد. در این روش اگر محلولی هیچ طول موج مرئی را از خود عبور ندهد به طور تئوری به رنگ سیاه است. اگر همه طول موج مرئی را عبور دهد و هیچ نوری را جذب نکند نمونه محلول به رنگ سفید است و اگر محلول رنگی داشته باشیم و نوری از آن عبور دهیم که مقداری از این نور جذب شود در این صورت این نور جذب شده دارای رنگ مکمل رنگ محلول می باشد، برای مثال اگر نمونه محلول رنگ زرد را جذب کند برابر 595 نانومتر به رنگ آبی ظاهر می شود چون آبی رنگ مکمل زرد است . در واقع در اسپکتروفتومتری مرئی باید طول موجی را انتخاب نمود که رنگ آن، مکمل رنگ محلول باشد.
با توجه به اینکه محلول های رنگی در رنگ مکمل خود حداکثر جذب نور را دارند بر اساس همین ویژگی مواد را در طول موج های مربوط به خود مورد بررسی قرار می دهند و شدت و ضعف این رنگ بستگی به مقدار ماده موجود در محلول دارد. بنابراین در دستگاه اسپکتروفتومتری مرئی به وسیله تجزیه گرها از جمله فیلتر، شبکه یا منشور، نور تک رنگ ایجاد می نمایند تا بتوان غلظت یک محلول رنگی را محاسبه کرد. در این دستگاه از فیلتر به عنوان مونوکروماتور استفاده م

1.2 روش رنگ سنجی اسپکتروفتومتری ( Colorimetry) در ناحیه مرئی تابش

ی شود. بنابراین بخش محدودی از طول موج قابل دسترسی می باشد.

2.2 روش اسپکتروفتومتری در ناحیه : UV- Visible

در دستگاه های اسپکتروفتومتری مرئی – فرابنفش، اساس اندازه گیری بر پایه تابش نور به آنالیت مورد آنالیز در طول موج های مختلف و بررسی میزان جذب و عبور آن می باشد. محدوده جذب در این ناحیه از 190 تا 1000 نانومتر می باشد.
در این روش با استفاده از قانون بیر – لامبرت می توان غلظت نمونه مورد آنالیز را اندازه گیری نمود.

1.2.2 قانون بیر و لامبرت (Beer & Lambert)

قانون بیر بیان می کند هنگامی که نور تک رنگی از داخل محلول عبور نماید، میزان نور جذب شده متناسب با غلظت مولکول هایی است که در مسیر اشعه نورانی قرار گرفته و نور را جذب می کنند و طبق قانون لامبرت ، تحت شرایط مساوی شدت نور خارج شده با افزایش طول مسیری که نور از محلول عبور میکند کاهش می یابد، بنابراین بر اساس قوانین بیر و لامبرت رابطه بین غلظت محلول و نور جذب شده به صورت خطی است و معمولا در محدوده ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد تعیین غلظت مواد انجام می شود.
این دستگاه شدت نور عبوری (I) از نمونه را با شدت اولیه (I0) مقایسه می کند. نسبت I/I0 ، “عبور” نامیده می شود که معمولا آن را با T% نشان می دهند. تعداد مولکول های جاذب نور در یک نمونه متناسب با میزان جذب آن در نمونه است و به صورت رابطه زیر بیان می شود :

A=جذب قابل اندازه گیری نور
ɛ=ضریب جذب مولی
b=ضخامت سل (طول مسیر عبور نور در نمونه)
c=غلضت

در نتیجه می توان نوشت:
A = log(l/T) = log I0/It = log ١٠ ɛ x b x c = ɛ x b x c

1.1.2.2 انحرافات از قانون بیر و لامبرت

عوامل انحراف از قانون بیر ولامبرت شامل انحرافات فیزیکی، انحرافات دستگاهی و انحرافات شیمیایی می باشد. انحرافات فیزیکی مربوط به محدودیت در غلظت ماده جاذب و وابستگی ضریب جذب مولی (ɛ) به ضریب شکست (n) می باشد. انحرافات دستگاهی به دلیل تک رنگ نبودن نور، آلودگی سل ها، خطی نبودن جریان حاصل در دتکتور با شدت نور تابشی، تغییر در مقدار برق و حرارت ایجاد می شود و انحرافات شیمیایی نیز ناشی از اثرات تفکیک، تجمع، تشکیل کمپلکس و یا حلال کافت و همچنین ناشی از اثرات فلورسانس و واکنش های فتوشیمیایی می باشد.

2 اجزای اسپکتروفتومتر UV – Visible

1.3 منبع تابش (Source)

نقش منبع نور دستگاه اسپکتروفتومتر تولید انرژی تشعشعی می باشد. منبع نور در اسپکتروفتومتر بسته به ناحیه مورد استفاده متفاوت می باشد. لامپ تنگستن طول موج های زیادی را به طور ممتد از خود منتشر می سازد که جهت اندازه گیری در منطقه مرئی و ماورابنفش از 350 تا 1100 نانومتر مورد استفاده قرار می گیرند. از آنجائی که در طول موج های پایین تر از 350 نانومتر پوشش شیشه ای فیلامان شروع به جذب می نماید بنابراین لامپ تنگستن جهت اندازه گیری طول موج های کمتر از ماورابنفش (190 تا 350 نانومتر) توصیه نمی شود. لامپ دوتریم در دستگاه اسپکتروفتومتر طیف ممتدی را در ناحیه ماوراء بنفش (190 تا 350 نانومتر) تولید می نماید. بنابراین جهت اندازه گیری طول موج های ناحیه ماورابنفش استفاده می شود. نحوه عملکرد لامپ ها در دستگاه اسپکتروفتومتر به این صورت است که زمانی که میزان جذب در طیف UV اندازه گیری می شود، لامپ دیگر خاموش می شود و هنگامی که اندازه گیری جذب در نور مرئی انجام می شود برعکس این مساله اتفاق میفتد که دلیل این امر جلوگیری از تداخل طول موجهای غیر ضروری در نور منتشر شده از نمونه است.

2.3 محفظه نمونه (Cell)

این قسمت برای نگهداری نمونه مورد آزمایش است، مدل های مختلفی در شکل و حجم های متفاوت برای انواع اسپکتروفتومترها و به نام های کووت، میکروسل، میکروپلیت، لوله آزمایش و غیره موجود است. در اسپکتروفتومترهای مرئی-فرابنفش، محفظه نگهدارنده نمونه، کووت به شکل مکعب مستطیل است. کووت باید نور تابشی را جذب نکند. کووت های شیشه ای در محدوده 340 نانومتر تا 1000 نانومتر برای امواج مرئی استفاده می شوند و نوع دیگر کووت که از جنس سیلیکا یا کوارتز ساخته شده اند و بافت سیلیکونی دارند در محدوده نور مرئی 220 نانومتر تا 340 نانومتر قابل استفاده هستند و برای ناحیه فرابنفش کاربرد دارند. هم چنین قطر کووت نیز بستگی به دستگاه دارد ولی معمولا 1cm می باشد. کوت هایی پلاستیکی هم وجود دارند که ارزان قیمت هستند و بیشتر در محدوده vis از آنها استفاده می کنند.

2.3 مونوکروماتور یا تک رنگ ساز

2.4 نقش مونوکروماتور دستگاه اسپکتروفتومتر جداسازی طول موج مورد نظر و خارج کردن موج های ناخواسته می باشد و باعث ایجاد نور تک رنگ می گردد. مونوکروماتور یک مجموعه متشکل از اجزایی است که نور سفید را به موج هایی با طول موج های متفاوت تبدیل می کند که در این میان هر طول موج برای قرائت غلظت نمونه کاربرد دارد.

اجزای مونوکروماتورشامل: یک شکاف که نور تولید شده به وسیله منبع نور را به یک سطح معین محدود می کند، مجموعه ای از آینه ها برای عبور نور از سیستم نوری، یک جز برای جداسازی طول موج های پرتو نور که ممکن است منشور یا شبکه انکسار یا انتقال (grating) باشد (منشورها اکنون کاربرد چندانی ندارند و بیشتر از شبکه انکسار استفاده میشود.). همچنین فیلترها نیز برای عبوردادن اشعه با فرکانس خاص و حذف سایر فرکانس ها بکار میروند و در نهایت یک خروجی برای انتخاب طول موجی که به نمونه تابیده می شود مورد استفاده قرار می گیرد.
طرز کار منشور در دستگاههای اسپکتروفتومتر از طریق تفاوت در ضریب شکست های نوردر ماده های مختلف می باشد که نور را به طول موجهای سازندش افتراق میدهد.
شبکه انکسار یا پراش به اثراتی گفته می شود که در اثر بریده شدن قسمتهایی از طول موج ایجاد میگردند. یک شبکه پراش را می توان هم در عبور تابش و هم در انعکاس تابش به کار برد، اما میزان و چگونگی پاشندگی طول موجهای برخوردکننده به شکل و حالت هندسی شبکه بستگی دارد.
فیلتر (grating) ساده ترین و ارزانترین نوع تکفام کننده نور است. فیلترها به این نحو عمل می کنند که تمام طول موجها را به خود جذب می کنند و یک طول موج از آنها رد می شود و این طول موج خیلی باریک نیست ، یعنی محدوده ای از طول موج را رد می کنند. از فیلتر برای کاربردهای خاص و یا عناصر و مواد خاص استفاده می شود که هزینه کمتری هم برای کاربر دارد.

4.3 آشکارساز (Detector)

آشکارسازها برای اندازه گیری شدت امواج بکار می روند و دارای خواص فتوالکتریک بوده که انرژی نورانی را به الکتریکی تبدیل می کنند.

1.4.3 فتوولتایی

در این آشکارساز تابش فتون به سطح نیمه هادی باعث خروج الکترون ها شده و الکترون های جدا شده توسط یک الکترود نقره جمع شده و پتانسیل تولید می نماید.

2.4.3 فتولوله (Tube Photo) :

در فتولوله ها جریان الکترون ها در اثر برخورد فوتون بوجود می آید. لوله خلاء است که دارای یک فتوکاتد پوشیده شده از Cs میباشد. فوتون های پرانرژی به کاتد ضربه می زنند و سبب نشر الکترون می شوند سپس الکترون ها بسمت آند رانده می شوند و بدین ترتیب جریان الکتریکی بوجود می آید.

3.4.3 فتومالتی پلایر یا چند لایه ساز نوری (PMT) Photo Tube Player Multi

این سیستم همان اساس فتولوله را دارد ولی دارای چندین کاتد و آند می باشد که هر الکترود نسبت به الکترود قبلی، آند ولی نسبت به الکترود بعدی کاتد است. در این حالت آبشاری از الکترون ها حاصل می شود و توسط میدان الکتریکی شتاب می گیرند. جریان تولید شده چندین بار تقویت می شود تا بتواند انرژی بسیار پایین یک فوتون را آشکارسازی و ثبت کند. حساسیت آنها نسبت به فتوتیوبها تا چندین برابر افزایش پیدا می کند. با این آشکارساز می توان جذب را با Resolution تا 6 رقم اعشار داشته باشد.

4.4.3 صفحه نمایشگر (Device Display)

اسپکتروفتومترها می توانند خروجی خود را بصورت های مختلف نمایش دهند. اما متداول تر است که ان را به کامپیوتر وصل کرده و برای آنالیز داده ها از نرم افزار استفاده کنند و ان را بصورت نموداری از مقدار عبور یا جذب بر حسب طول موج نمایش می دهند.

4 انواع اسپکتروفتومتری از نظر ساختمانی

1.4 تک پرترویی (Single Beam)

این نوع سیستم طوری طراحی شده که تمام نور از یک نمونه عبور می کند. در اینجا بایستی جذب یک نمونه جاذب با جذب نمونه بلانک مقایسه گردد. در ابتدا با استفاده از سل حاوی حلال، پراکنش Transmittance به 100% یا جذب Absorbance به روی صفر تنظیم شده، سپس آن را با سل حاوی نمونه جایگزین می نمایند. در نهایت جذب نمونه (آنالیت) را ثبت نموده و یا بصورت دستی این دو را از هم کم می کنند.

2.4 دوپرتویی (Double Beam)

این نوع پیکربندی، نور مونوکروماتور را به دو پرتو با استفاده از آینه ها مانند یک آینه چرخشی و یک آینه نیمه شفاف تقسیم می کند. تا دو پرتو، پرتو نمونه و پرتو شاهد را ایجاد کند. در سیستم دو پرتویی عمل حذف جذب شاهد بصورت اتوماتیک بوده و عمل مقایسه بین شاهد و نمونه در هر ثانیه چندین بار انجام می گیرد.