دستگاه کروماتوگرافی مایع (HPLC) چیست و نحوه کارکرد آن

کروماتوگرافی مایع یا HPLC دستگاهی است که برای جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری مقادیر کم از مواد کاربرد دارد. این محصول برای آزمایشگاه‌های دانشگاهی و صنعتی که به شناسایی و تعیین کمیت مخلوط‌های ترکیبات آلی نیاز دارند، استفاده می‌شود. دستگاه کروماتوگرافی مایع ویژگی‌ها و مشخصاتی دارد که آن را برای جداسازی اجزای یک مخلوط آلی از ترکیبات ناپایدار استفاده می‌کنند. در ادامه این مطلب با سایت فرازما همراه باشید تا بیشتر HPLC را برایتان بررسی کنیم.

دستگاه کروماتوگرافی چیست؟

برای شناخت بهتر دستگاه HPLC باید ابتدا با فرآیند کروماتوگرافی آشنا شوید. به زبان ساده HPLC یک تکنیک تحلیلی است که برای جدا کردن اجزای یک مخلوط آلی از ترکیبات غیرفرار (که از نظر حرارتی ناپایدار هستند و وزن نسبتاً مولکولی بالایی دارند) استفاده می‌شود.

در واقع می‌توان گفت دستگاه کروماتوگرافی مایع زمانی استفاده می‌شود که بخواهیم ترکیبات از مقیاس میلی‌گرم تا گرم را خالص کنیم. با یک مثال ساده می‌توان کارکرد این دستگاه را توضیح داد:

فرض کنید ماده A و ماده B را اگر با هم ترکیب کنیم، به هم واکنش نشان می‌دهند و ماده C بدست می‌آید. حالا دستگاه کروماتوگرافی باید مواد ترکیب شوند (A و B) و ماده جدید C را از یکدیگر جدا کنید. دستگاه HPLC برای جدا کردن و خالص کردن اجزای یک ترکیب آلی کاربرد دارد.

کاربردهای دستگاه کروماتوگرافی

دستگاه HPLC کاربردهای زیادی دارد که عبارتند از:

• استفاده برای شناسایی ترکیبات
• مشخص کردن خصوصیات پیوندهای مولکولی درون ترکیبات
• انجام تست خلوص
• جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی پروتئین‌ها درتعیین میزان غلظت برخی از داروها
• انجام کمی سازی مولکولی
• استفاده برای تصفیه آب
• تعیین ساختار پلیمرها
• استفاده برای تشخیص ناخالصی‌ها در صنایع داروسازی
• کاربرد کروماتوگرافی برای اندازه‌گیری اجزای کم مصرف
• استفاده برای تبادل یونی پروتئین‌ها
• استفاده برای تبادل آنیونی با pH بالا کربوهیدرات‌ها و الیگوساکاریدها

نحوه عملکرد HPLC

در این دستگاه اجزای جدا شده بر اساس جذب نور یا تغییر در ضریب شکست، تغییرات الکتروشیمیایی/رسانایی یا به سادگیِ توزیع اندازه مولکول‌ها، شناسایی می‌شوند. خروجی این دستگاه توسط یک نرم‌افزار مورد نظارت و ارزیابی قرار می‌گیرد. این کار برای انجام محاسبات روی نتیجه تجزیه اجزا محلول صورت می‌گیرد. همچنین پارامترهای عملیاتی مانند حجم تزریق، توالی تزریق، طول موج تشخیص و غیره نیز بدست می‌آید.

دستگاه HPLC کمک زیادی به رشد و درک شیمی تجزیه کرده است. از سوی دیگر بر روی کیفیت محصولات مصرفی مثل نوشیدنی‌ها، موادغذایی، داروها، پلیمر و نظارت بر محیط زیست هم تاثیر مثبتی بر جا گذاشته است. در این دستگاه برای شناسایی ترکیبات و آزمایش‌های تصفیه دارویی کاربرد زیادی دارد. به طوری که قادر است بیش از 60 درصد از مولکول‌های موجود در داروها را شناسایی کند.

حالا اگر یک دارو واردات باشد و نمونه این محصول در بازارهای داخلی موجود نباشد، با کمک دستگاه کروماتوگرافی به راحتی می‌توان اجزای تشکیل دهنده دارو را جزء به جزء تشخیص داد و نمونه داخلی آن را تولید کند.

اگر این این محصول به درستی مراقبت شود و بتوانید با آن دقیق کار کنید، نتایج و تجزیه و تحلیل مطمئنی را برایتان فراهم می‌کند.

مزیت‌های استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع

مزایای کلیدی دستگاه‌ HPLC به شرح زیر است:

• این دستگاه یک ابزار دقیق برای کنترل و خودکار ترکیبات آلی است.
• از این دستگاه می‌توان برای مدیریت داده ها، ویژگی‌های امنیتی، و گزارش و اعتبار سنجی استفاده کرد.
• این محصول قدرتمند و سازگار است و از آن می‌توانید برای هر ترکیبی اعم از دارو و غذا استفاده کنید.
• دستگاه کروماتوگرافی با مدیریت تمام حوزه‌های تجزیه و تحلیل (از جداسازی تا ارائه گزارش) را با دقت انجام می‌دهد.
• باعث کاهش هزینه‌ها می‌شود.

اجزای دستگاه کروماتوگرافی

این دستگاه از چندین قسمت تشکیل شده است که هر یک در انجام فرآیند جداسازی مولکول‌های محلول نقش دارند. این قسمت‌ها عبارتند از:
فاز مایع
فاز مایع با سرعت ثابتی به ستون مملو از فاز ثابت، پمپاژ می‌شود. حالا قبل از اینکه فاز مایع داخل ستون وارد شود، باید نمونه آنالیز به جریان حامل تزریق شود. وقتی فاز مایع وارد ستون شد، اجزای نمونه را به صورت رندوم و بر اساس برهمکنش‌های فیزیکوشیمیایی بین مولکول‌های آنالیت و فاز ساکن نگهداری می‌کنند.

فاز متحرک
یکی دیگر از اجزای دستگاه کروماتوگرافی مایع فاز متحرک است که برای انتقال نمونه به سیستم کاربرد دارد. فاز متحرک نسبت به اجزای نمونه هیچ واکنشی نشان نمی‌دهد. برای این کار اغلب از حلال‌های خالص و یا محلول بافر استفاده می‌شود. ضمن اینکه نباید در فاز متحرک ناخالصی ذرات وجود داشته باشد و قبل از استفاده هم حتما آن را گاززدایی کنید.

مخازن فاز سیار
برای ذخیره کردن و حمل و نقل فاز متحرک از مخازن فاز سیار استفاده می‌کنند. این قسمت به صورت یک بطری شیشه‌ای بسیار شفاف است تا بتوانید به راحتی محلول داخل آن را بررسی کنید. در داخل این بطری یک فیلتر ذرات فولاد ضدزنگ هم وجود دارد تا ناخالصی‌های ذرات در فاز متحرک راحذف کند.

جهت مشاهده راهنمای خرید ستون HPLC کلیک نمایید

پمپ‌ها HPLC
اگر به دلیل تغییرات در نرخ جریان فاز متحرک، زمان شستشوی اجزای نمونه، تحت تاثیر قرار گرفت و نتیجه آنطور که باید بشود، صورت نگرفت، پمپ‌ها وارد عمل می‌شوند. در واقع برای جلوگیری از خطا در نتیجه کار، پمپ‌ها جریان ثابت فاز متحرک را به ستون تحت فشار ثابت ارائه می‌دهند.

انژکتورها
انژکتورها برای تزریق حجم ثابت نمونه به جریان فاز متحرک کاربرد دارند. برای اینکه دقت کار بالا برود، بی‌اثر بودن و تکرارپذیری تزریق ضرورت دارد.
ستون کروماتوگرافی
یکی دیگر از اجزای دستگاه کروماتوگرافی که برای انجام تجزیه و تحلیل ضرورت دارد، ستون است. این قسمت به صورت یک لوله فولادی ضدزنگ ساخته می‌شود که با استفاده از یک فاز ثابت آن را بسته‌بندی می‌کند. وجود ستون برای عملکرد HPLC ضرورت دارد و باید از آن به خوبی مراقبت کنید تا در جداسازی و تکرارپذیری با دقت عمل کند.

کوره ستونی
تغییر دما در طول فرآیند کروماتوگرافی می‌تواند منجر به تغییر دما می‌شود. حالا در اینجا کوره ستونی وارد عمل می‌شود تا با استفاده از گردش هوا، دمای ستون را ثابت نگه دارد. به این صورت که نرخ جریان ثابت فاز متحرک را از طریق ستون تضمین می‌کند.

آشکارساز
از دیگر قطعاتی که در یک دستگاه HPLC ایفای نقش می‌کند، آشکارساز است. این قسمت برای ایجاد حساسیت و واکنش برای اجزای جدا شده محلول (توسط ستون) کاربرد دارد. آشکارساز باید از هرگونه تغییر در ترکیب فاز متحرک عمل کند. آشکارساز برای کارکرد خود به برنامه تشخیص UV-VIS نیاز دارد.

تحلیل و کنترل داده‌ها
سیستم‌های HPLC مدرن با کمک رایانه عمل می‌کنند. به این صورت که نتایج آن از طریق نرم‌افزارهایی که بر روی رایانه هستند، تحلیل می‌کنید. حالا این نرم‌افزار می‌تواند پارامترهای عملیاتی مانند ترکیب فاز متحرک، دما، سرعت جریان، حجم تزریق و توالی و همچنین دریافت و درمان خروجی را به طور دقیق کنترل ‌کند.

انواع دستگاه HPLC

دستگاه کروماتوگرافی مایع انواع مختلفی دارد که مکانیسم جداسازی و نوع فاز ساکن آن‌ها را دسته بندی می‌کنند. انواع این محصول در بازار عبارت است از:

• کروماتوگرافی کایرال
• کروماتوگرافی افینیته
• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی اندازه – طردی
• کروماتوگرافی جذب سطحی
• کروماتوگرافی تعویض یونی

نکاتی برای خرید دستگاه کروماتوگرافی

با توجه به اهمیت و کاربردهای متعددی که این دستگاه برای آزمایشگاه‌ها دارد، زمان انتخاب آن باید به چند نکته مهم دقت داشته باشید. در حال حاضر شرکت‌های زیادی در زمینه تولید HPLC فعالیت دارند که برخی از آن‌ها نیز در ایران هستند. برای خرید کروتوماگرافی مایع خوب به موارد زیر دقت داشته باشید:

پشتیبانی از تمامی مراحل تحقیق

یکی از مهم‌ترین معیارها برای خرید دستگاه کروماتوگرافی مایع توجه به قدرت تجزیه و تحلیل آن برای هر نوع تحقیقی است. این دستگاه باید بتواند برای هر شرایط و در هر آزمایشگاه علوم زیستی به خوبی عمل کند. شرکت‌های داروسازی، موادغذایی و نوشیدنی به تجزیه و تحلیل محلول‌های شیمیایی نیاز دارند. حالا HPLC خریداری شده باید بتواند نیاز آن‌ها را برطرف کند.

توجه به قیمت محصول

قیمت کروماتوگرافی مایع خارجی بین 30 تا 65 هزار دلار است. البته قیمت سیستم‌های HPLC کمتر از UPLC در محدوده 55 تا 120 هزار دلار است. در مورد دستگاه‌های ایرانی قیمت پایین‌تر محاسبه می‌شود و همان کارایی دستگاه‌های خارجی را نیز دارند. ضمن اینکه شما باید در کنار قیمت دستگاه کروماتوگرافی مایع هزینه‌های جاری شامل نگهداری، پشتیبانی و مواد مصرفی را هم درنظر بگیرید.

حالا اگر یک محصول خوب و باکیفیت را خریداری کنید، هزینه‌های جاری کاهش می‌یابد.

توجه به آشکارسازهای HPLC

دیود نوری (PDA) و جذب اشعه ماوراء بنفش قابل تنظیم (TUV) رایج‌ترین انواع آشکارسازهای مورد استفاده در علوم زیستی، به ویژه در آزمایشگاه‌های بزرگ هستند. این دو آشکارساز قادرند کروموفورها را شناسایی کنند. همچنین آشکارساز TUV برای نظارت تا چهار طول موج قابلیت تنظیم دارند. اگر قصد استفاده از کروماتوگرافی برای آنالیز دارویی با مولکول‌های کوچک و یا برای محصولات طبیعی یا بیودارویی با مولکول‌های بزرگ را دارید، محصولاتی را که حاوی آشکارساز PDA و TUV هستند، خریداری کنید.

اگر می‌خواهید مولکول‌های حاوی فلوروفورها را تشخیص دهید، محصولی را که آشکارسازهای FLR دارد، خریداری کنید. آشکارسازهای FLR برای نمونه‌های محیطی یا مواد غذایی حاوی فلوروفور و یا برای پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه یا گلیکان‌ها، مناسب هستند.

توجه به ترکیب مسیر سیال

عامل دیگر در انتخاب و خرید دستگاه کروماتوگرافی مایع یا HPLC باید مدنظرتان قرار بگیرد، ترکیب مواد مسیر سیال است.  فولاد ضدزنگ و تیتانیوم دو آلیاژی هستند که بیشترین کاربرد را برای مسیر سیال این دستگاه استفاده می‌شود. فولاد ضدزنگ نسبت به تیتانیوم بهتر است و در مقابل خوردگی هم مقاومت بالایی دارد.

قیمت دستگاه کروماتوگرافی مایع چقدر است؟

این محصول قیمت متفاوتی در بازار دارد که برند و کیفیت دستگاه تعیین کننده قیمت آن است. ضمن اینکه نوسانات بازار ارز و تورم هم در تعیین قیمت HPLC تاثیرگذار است. به هر حال عوامل زیادی وجود دارد که قیمت این محصول برحسب آن‌ها مشخص می‌شود.

منابع: lab-training و azom